Amplisens hcv fl

Symptomer

Fra varmen i lisses, parker og haver er nøglerne aktive. Tom perebuvayuchi på naturen, hvor du kan se om vslnu pekeren, abi.

2017/03/01

AmniSure test

Du kan også købe en test til bestemmelse af lækage af fostervand fra gravide Amnyshur i apoteker i Kiev:
1. Apotek "Arnica".

2016/08/26

FLOROTSENOZ

En omfattende test af den nye generation til diagnosticering af ALLE klinisk signifikante infektioner i urogenitale kanaler hos kvinder i reproduktiv alder..

VEJLEDNING. "AmpliSense HCV-genotype-FL" AmpliSense

udskrift

1 INSTRUCTION til anvendelse af kittet reagenser til påvisning og differentiering af genotyper af hepatitis C (HCV) i klinisk prøvemateriale ved polymerasekædereaktion (PCR) med hybridisering-fluorescensdetektering i "real time" mode "AmpliSens HCV-genotype-FL» AmpliSens forbundsbudget institution of Science "Central Research Institute of Epidemiology", Den Russiske Føderation,, Moskva, Novogireevskaya street, 3a

2 INDHOLD LISTE OVER FORKORTELSER. 3 FORMÅL. 3 METODETS PRINCIP. 3 FORMATER OG UDFORMNINGSFORMER FOR REAGENS KIT. 5 ANALYTISKE EGENSKABER. 5 FORHOLDSREGLER. 6 YDERLIGERE MATERIALER OG UDSTYR. 7 FORBINDELSE, TRANSPORT OG OPBEVARING AF DET UNDERSØGTE MATERIALE. 9 SAMMENSÆTNING ASPECT FRT PCR-RNA ekstraktion fra UNDERSØGELSER Specimen ARRANGEMENT revers transkriptionsreaktion A. Fremstilling rør til revers transkription B. Gennemførelse af en revers transkriptionsreaktion amplifikation med detektion i "real time" af A. Fremstilling rør A1 til amplifikation. Fremstilling af amplifikationsrør ved anvendelse af PCR kit reagens kit. FRT-G A2 variant. Fremstilling af reagensglas til amplifikation under anvendelse af kit-reagenser "PCR-kit" variant FRT-G B. Gennemførelse amplifikation detektion i "real time" Analyse og tolkning af resultater HOLDBARHED, transport og opbevaring APPENDIKS 1. EKSTRAKTION AF RNA anvendelse af kittet af reagenser " ribo-sorb "BILAG 2. RNA ekstraktion med REAGENSSÆTTET" ribo-prep "Symboler i trykkeriprodukt x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / s. 2 af 32

3 FORKORTELSER Følgende forkortelser og symboler i denne vejledning: DNA dezoksirubonukleinovaya syre cDNA komplementært DNA RNA ribonucleinsyre fra revers transkription af EKO intern kontrolprøve OKO negativ kontrol PKO positiv kontrol K + - positiv kontrol PCR K - negativ kontrol-PCR OK - negativ PCR-udvinding styring af polymerasekædereaktion FBUN Central Research Institute of Epidemiology HCV FRT FORMÅL føderale budget etableret ix Science "Centrale Forskningsinstitut for Epidemiologi" af føderale tjeneste for Tilsyn med forbrugerrettigheder Beskyttelse og menneskelig velfærd i virus fluorescenspåvisning hepatitis C i "real time" Reagenser "AmpliSens HCV-genotype-FL" er beregnet til påvisning og differentiering af virus genotyper hepatitis C (HCV) i klinisk prøvemateriale ved polymerasekædereaktion (PCR) med hybridisering-fluorescensdetektering i "real time". Bestemmelse af HCV-genotyper 1a, 1b, 2, 3a, 4 sker via "PCR-kit" variant FRT-G1-4; bestemmelse genotyper HCV 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a, 6 foregår via "PCR-kit" variant FRT-g1-6. Dette reagens kit anbefales at bruge efter detektering af HCV-RNA i prøver under anvendelse kits designet til både kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af HCV-RNA (fx "AmpliSens HCV-FL» under anvendelse gibridizatsionnofluorestsentnuyu opsporing eller "AmpliSens HCV ERH "ved hjælp elektroforetisk detektion af amplifikationsprodukter (fremstillet FBUN Epidemiologisk CRI)). ADVARSEL! PCR analyseresultater registreres i den komplekse sygdomsdiagnose 1. PRINCIP METODE 1 I overensstemmelse med EU-direktiv 98/79 / EF. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 3 af 32

4 er baseret på princippet om testning af RNA-ekstraktion fra blodplasma sammen med rekombinant indre kontrolprøve (ASD), udfører RNA revers transkriptionsreaktion og PCR-amplifikation af cDNA gibridizatsionnofluorestsentnoy detektion i "real time". For at udelukke falsk-negative resultater i undersøgelsen indtastet EKR, som giver dig mulighed for at styre alle faser af analyse og evaluere effekten af ​​PCR-inhibitorer på resultaterne af undersøgelsen. Bestemmelse af genotype af HCV enkelt prøve holdes i flere rør, hvert rør i to opdelte HCV genotype, eller en genotype og HCV EKO. Sættet er designet til instrumenter med to eller flere fluorescensdetekteringskanaler. Tabellen viser kanalerne ved hvilke HCV genotyper detekteres for hver reaktionsblanding. Reaktionsblandingen 1b / 3a 1a / 2 EKR / 4 5a / 6 genotyper 2 Channel påviselig HCV FAM / Grøn 1b 1a ASD 5a JOE / HEX / gul / Cy3 3a er en del af "PCR-kit" variant FRT-g1-6. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 4 af 32

5 FORMAT OG EXHAUST KIT AF REAGENSER Reagent kit fremstillet i et format: Formatet for FRT Reagent kit fremstillet i 7 danner sæt: Form 1 indbefatter reagenskits "ribo-sorb" variant 50 "Reverte-L» option 50, "PCR kit" FRT-g1-4-variant. Form 2 indbefatter reagenskits "ribo-prep" variant 50 "Reverte-L» option 50, "PCR-kit" variant FRT-G1-4. Form 3 indeholder "PCR kit" reagens kit option FRT-g1-4. Form 4 indbefatter kits af reagenser "ribo-sorb" variant 50 "Reverte-L» option 50, "PCR-kit" variant FRT-g1-6. Form 5 indbefatter kits af reagenser "ribo-prep" variant 50 "Reverte-L» option 50, "PCR-kit" variant FRT-g1-6. Form 6 indeholder "PCR kit" reagens kit option FRT-g1-6. Formular 7 indbefatter bulkreagensæt, pakket i separate reagenser med mærkning af reagenser på deres bulkemballage. Faconudformning 1, 2, 3 er udformet til at bestemme genotyper 1a, 1b, 2, 3a, 4 C. Former for HBV samling 4, 5, er 6 udformet til at bestemme genotyper 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a, 6 HCV C. danner samlingen 1, 2, 4, 5 er udformet til at udføre en omfattende PTsRissledovaniya herunder ekstraktion af RNA fra klinisk materiale, ledende revers transkription af RNA og PCR-amplifikation af cDNA gibridizatsionnofluorestsentnoy detektion i "real time". Danne et komplet sæt af 3 og 6 anvendes til PCR-amplifikation af cDNA-hybridisering-fluorescenspåvisning i "real time". At foretage en komplet analyse er nødvendigt at anvende reagenskits FBUN Production Research Institute Epidemiologisk til RNA-ekstraktion (reagenskits "ribo-sorb" eller "ribo-prep"), og revers transkriptionsreaktion (kit reagens "Reverte-L»). Formen af ​​et komplet sæt 7 er beregnet til produktionsformål til den efterfølgende markering på kundens sprog og et komplet sæt på sæt. ADVARSEL! Ved hjælp af 7 danner en komplet sæt kun i overensstemmelse med de regler, der er godkendt FBUN Central Research Institute of Epidemiology. ANALYTISKE HARAKTISTIKI 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / s. 5 af 32

6 Analytisk følsomhed udvinding Volumen, l kit til ekstraktion RNA / DNA-100 "ribo-sorb" 100 "ribo-prep" kit til amplifikation og påvisning "PCR-kit" variant FRT-G1-4, «PCR-kit" udførelsesform FRT- g1-6 «PCR-kit" variant FRT-G1-4, «PCR-kit" variant FRT-g1-6 analytiske sensitivitet viste IE / ml 5x10 3 2,5x10 3 analytisk specificitet Assessment analytisk reagens kit specificitet ingen krydsreaktion mellem genotyperne 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a og 6 af hepatitis C-virus ved hjælp af meget rekombination de covariant positive kontrolprøver og blod plasmaprøver svarende til HCV-genotyper. FORHOLDSREGLER arbejde skal udføres i laboratoriet udfører molekulyarnobiologicheskie (PCR) studerer kliniske prøver for tilstedeværelsen af ​​infektiøse agenser i overensstemmelse med sanitære-epidemiologiske regler SP "Security arbejde med mikroorganismer III IV patogenicitet grupper (hazard) og aktivatorer af parasitsygdomme", Sanpin "Sanitary -epidemiologiske krav til behandling af medicinsk affald "og retningslinjer MU" Tilrettelæggelse af laboratorier ved anvendelse af amplifikationsmetoder n kleinovyh syrer ved arbejde med materialer, som indeholder mikroorganismer patogenicitet grupperne I IV". Under drift altid opfylde følgende krav: - Det bør betragtes som de prøver af infektiøse og farlige arbejde at organisere og opbevaring i overensstemmelse med SP "Security arbejde med mikroorganismer III IV patogenicitet grupper (hazard) og parasitære smitstoffer." - Til rengøring og desinfektion flaske prøver eller reagenser ved anvendelse af desinfektionsmidler i overensstemmelse med SP "Security arbejde med mikroorganismer III IV patogenicitet grupper (hazard) og parasitære smitstoffer." - Laboratorieprocessen skal være ensrettet. Analysen udføres i 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p. 6 af 32

7 separate værelser (zoner). Arbejdet skal begynde i udvælgelseszonen, fortsæt i forstærkning og detektionszone. Returner ikke prøver, udstyr og reagenser til det område, hvor den foregående fase af processen blev udført. - Fjern ubrugte reagenser i overensstemmelse med SanPiN "Sanitære og epidemiologiske krav til håndtering af medicinsk affald." ADVARSEL! Ved afmontering af affald efter amplifikation (rør indeholdende PCR-produkter) afvises åbning af rørene og skvulpe indholdet, da dette kan føre til forurening af PCR produkter laboratorium område, udstyr og reagenser. Brug sættet strengt til det tilsigtede formål, ifølge denne vejledning. Tillad kun specialt uddannet personale at arbejde med sættet. Brug ikke kittet efter udløbsdatoen. Brug engangshandsker, lab coat, beskyt øjnene, mens du arbejder med prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter arbejdet. Undgå kontakt med hud, øjne og slimhinder. Ved kontakt, skyll straks det berørte område med vand og søg lægehjælp. Materialesikkerhedsdatablad (MSDS materialesikkerhedsdatablad) er tilgængelig på forespørgsel. YDERLIGERE MATERIALER OG UDSTYR OMRÅDE 1. Ekstraktion af RNA fra klinisk materiale 1. sæt reagenser til RNA / DNA "ribo-sorb" (N) "ribo prep" (TU) eller andre anbefalede FBUN CRI Epidemiologisk når man arbejder med komplette former 3, Laminar boks. 3. Vortex. 4. Mikrocentrifuge til Eppendorf type rør op til 12 tusind g. 5. Termostat til rør såsom "Eppendorf" fra 25 til 100 C. 6. Salgsautomater af variabelt volumen (fra 5 til 50 pi, 20 pl til 200 og fra 100 til 1000 l). 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 7 af 32

8 7. Disponibel polypropylen skrues ned eller tæt lukker 1,5 ml rør. 8. Disposable tips med filter op til 100 μl, op til 200 μl og op til 1000 μl i stativ. 9. Vakuum medicinsk aspirator med en kolbefælde for at fjerne supernatanten. 10. Engangs tips op til 200 μl pr stativ. 11. Stativ til 1,5 ml rør. 12. Køleskab fra 2 til 8 С. 13. Separat badekåbe, hatte, sko og engangshandsker i henhold til MU Kapacitet med desinfektionsmiddel. ZONE 2. Gennemførelse af omvendt transkription og amplifikation i realtidsmodus 1. Reagens kit til udførelse af omvendt transkriptionsreaktion "REVERTA-L" (TU), når der arbejdes med konfigurationsformularer 3, æske af abakterielt luftmedium (PCR-boks). 3. Centrifuge / Vortex. 4. Automatiske dispensere med variabelt volumen (fra 5 til 50 μl og fra 20 til 200 μl). 5. Engangsspidser med filter op til 100 μl og op til 200 μl i stativ. 6. Stativ til 0,5 ml rør eller 0,2 ml eller 0,1 ml (alt efter hvilken type rør der anvendes). 7. Køleskab fra 2 til 8 С med fryser ikke højere end minus 16 С. 8. Separat kjole, hatte, sko og engangshandsker i henhold til MU Kapacitet til udledning af tips. Ved omvendt transkriptionsreaktion ved brug af "REVERET-L": 10. Engangs polypropylenrør med et volumen på 0,2 ml eller 0,5 ml (afhængig af modellen af ​​termostat eller forstærker, der anvendes, hvor reaktionen ved revers transkription udføres). 11. Termostat til Eppendorf-type rør fra 25 til 100 ° C eller en programmerbar forstærker (for eksempel Terzik (DNA Technology, Russia), Gradient Palm Cycler (Corbett Research, Australien), GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, USA)). 12. Ved opstilling af revers transkriptionsreaktionen for mindre end 10 undersøgte 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / p. 8 af 32

9 prøver automatisk dispenser med variabelt volumen (fra 0,5 til 10 μl). 13. Ved opstilling af revers transkriptionsreaktionen for mindre end 10 prøver undersøgt, engangstips med filter op til 10 μl pr stativ. Når du arbejder med "PCR kit": 14. Programmerbare roterende type forstærkere (for eksempel Rotor-Gene 3000 eller 6000 (Corbett Research, Australien), Rotor-Gene Q (Qiagen, Tyskland)) eller tablet-type forstærkere (fx icycler iq5 (Bio-Rad, USA)) eller SmartCycler II-forstærkeren (Cepheid, USA) eller Mx3000P, Mx3005P (Stratagene, USA) og anbefalet af FBUNs Centralforskningsinstitut for Epidemiologi i Rospotrebnadzor i de metodologiske anbefalinger vedrørende brugen af ​​dette reagenssæt. 15. Engangs polypropylenrør til PCR: a) Tyndvæggede rør til PCR med et volumen på 0,2 ml med en konvekse hætte (ustrakte eller strippede), når der anvendes en tablettype-enhed; b) Tyndvæggede 0,2 ml PCR-rør med en flad kapsel (ubelastet) eller strimmelrør med et volumen på 0,1 ml ved hjælp af en roterende enhed. c) 0,025 ml PCR rør (Cepheid, USA) ved anvendelse af et SmartCycler II instrument (Cepheid, USA). 16. Etiket stativ (når du bruger tabletter). 17. Engangs polypropylenrør til PCR (flad hætte, ikke-standard) til 0,5 ml 18. Centrifuge og reagensrørstativ (Cepheid, USA) ved brug af SmartCycler II (Cepheid, USA). FORBINDELSE, TRANSPORT OG OPBEVARING AF MATERIALET I STUDIEN Før du påbegynder arbejdet, skal du gøre dig fortrolig med de metodiske retningslinjer "Tage, transportere, lagre klinisk materiale til PCR-diagnostik" udviklet af FGUN TsNIIE Rospotrebnadzor, Moskva, 2008. Til PCR-undersøgelsen anvendes perifert blodplasma. For at opnå plasma indtages blod i et reagensglas med 3% EDTA-opløsning med en hastighed på 20: 1 (20 dele blod pr. 1 del EDTA). Drej det lukkede reagensglas med blod flere gange. Inden for 6 timer fra blodindsamlingstidspunktet skal plasma opsamles og overføres til et nyt rør. For at gøre dette centrifugeres røret med blod i 20 minutter ved g, hvorefter plasmaet tages og overføres til en separat disponibel 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / p. 9 af 32

10 reagensglas. Plasma kan opbevares i mere end 3 dage ved en temperatur på 2 til 8 ° C og i lang tid ved en temperatur ikke højere end minus 68 ° C. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / p. 10 ud af 32

11 FRT FORMAT FRT FORMAT COMPOSITION RIBO-Sorb reagens kit version 50 reagens kit til isolering af RNA / DNA fra klinisk materiale indeholder: Reagens Beskrivelse Volumen, ml Antal Lysis opløsning Opløsning til vask 1 Opløsning til vask 3 Opløsning til vask, 5 1 hætteglas hætteglas 50 1 hætteglas 20 1 hætteglas Sorbent Hvid suspension 1,25 1 rør RNA buffer 0,5 5 rør Reagensættet er designet til at isolere RNA / DNA fra 50 prøver, herunder kontroller. Inkluderet i sammensætningen af ​​det komplette sæt 1 og 4. Reibent kit "RIBO-prep" version 50 reagens kit til isolering af RNA / DNA fra klinisk materiale indbefatter: Reagens Beskrivelse Volumen, ml Mængde Løsning til lysis Opløsning til udfældning Opløsning til vask 3 Løsning til vaske 4 RNA-buffer Gennemsigtig blåfarvet hætteglas 20 1 hætteglas 25 1 hætteglas 10 1 hætteglas 1,2 4 rør Reagensættet er konstrueret til RNA / DNA-isolering fra 50 prøver, herunder kontroller. Inkluderet i form af picking 2 og 5. Reverse-L reagens kit option 50 reagens kit til 3 Ved opbevaring af en lyseringsopløsning, en lysisopløsning og en vaskeopløsning 1 ved en temperatur på 2 til 8 C, kan et bundfald danne form som krystaller. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 11 af 32

12 FRT FORMAT til cdna-produktion på en RNA-skabelon omfatter: RT-G-mix-1 RT-mix-revertase (MMlv) DNA-buffer Reagensbeskrivelse Volumen, ml Antal 0,01 5 rør 0,125 5 rør 0,03 1 rør 1, 2 1 rør Reagensæt version 50 er designet til at udføre 60 revers transskriptionsreaktioner, herunder kontroller. Reagensætet "PCR kit". FRT-g1-4-versionen af ​​kit til PCR-amplifikation af cdna-genotyper (1a, 1b, 2, 3a, 4) af HCV med realtids hybridiseringsdetektering indbefatter: PCR-blanding 1- FRT HCV genotyper 1b / 3a PCR mix-1-FRT HCV genotyper 1a / 2 PCR mix-1-FRT HCV EKO / genotype 4 Reagens Beskrivelse Volumen, ml Count RT-PCR mix-2-FEP / FRT Polymerase (TaqF) HCV cdna PKO genotyper 1b / 3a HCV cdna PKO genotyper 1a / 2 PKO cdna HCV CTP / genotype 4 TE buffer 0,6 1 rør 0,6 1 rør 0,6 1 rør 0,3 3 rør 0,03 3 reagensglas 0,2 1 reagensglas 0,2 1 reagensglas 0,2 1 reagensglas 0,5 1 reagensglas K Reagensættet er designet til 55 tests (165 amplifikationsreaktioner), herunder kontroller. Inkluderet i sæt af konfigurationer 1, 2 og 3. Valgprøverne er fastgjort til reagenssætet: 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 12 af 32

13 FRT FORMAT Reagens Beskrivelse Volumen, ml Mængde OKO VKO STI-248-rec 0,5 1 rør 0,5 1 rør Test kit "PCR kit" version FRT-g1-6 kit til PCR amplifikation af cdna genotyper ( 1a, 1b, 2, 3a, 4a, 5a, 6) HCV med realtids hybridisering-fluorescensdetektering indbefatter: Reagensbeskrivelse Volumen, ml Mængde PCR mix-1-FRT HCV genotyper 1b / 3a PCR mix- 1-FRT HCV genotyper 1a / 2 PCR-mix-1-FRT HCV VKO / genotype 4 PCR-mix-1-FRT HCV genotyper 5a / 6 OT-PCR-mix-2-FEP / FRT Polymerase (TaqF) PKO cdna HCV genotyper 1b / 3a PKO cdna HCV genotyper 1a / 2 PKO cdna HCV EKO / genotype 4 PKO cdn HCV genotyper 5a / 6 TE-buffer 0,6 1 testrør 0,6 1 testrør 0,6 1 testrør 0,6 1 testrør 0,3 4 reagensglas 0,03 4 reagensglas 0,2 1 reagensglas 0,2 1 reagensglas 0, 2 1 rør 0,2 1 rør 0,5 1 rør Reagensættet er designet til 55 tests (220 amplifikationsreaktioner), herunder kontroller. Inkluderet i sæt af konfiguration 4, 5 og 6. Til reagenssættet fastlagte kontrolprøver af udvælgelsestrinnet: 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 13 af 32

14 FRT FORMAT Reagens Beskrivelse Volumen, ml Mængde OKO VKO STI-248-rec 0,5 1 testrør 0,5 1 testrør PRØVNING AF PCRFORSKNING PCR-studiet består af følgende trin: Ekstraktion af RNA fra de undersøgte prøver. Gennemførelse af omvendt transkriptionsreaktion. Amplifikation med hybridisering-fluorescens detektion i "real time" mode. Analyse og fortolkning af resultater. Detaljerede oplysninger om proceduren for gennemførelse af PCR-undersøgelser er angivet i "Metodologiske retningslinjer for anvendelse af et reagenssæt til bestemmelse og differentiering af genotyperne af hepatitis C-viruset (HCV) i klinisk materiale ved anvendelse af fremgangsmåden til polymerasekædereaktion (PCR) med hybridisering-fluorescensdetektion" AmpliSense HCV-genotype-FL ", udviklet af FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor. EKSTRAKTION AF RNA FRA UNDERSØGTE PRØVNINGER ATTENTION! Ved arbejde med RNA er det nødvendigt at bruge kun engangsprodukter med specielle mærker "RNasefree", "DNase-free". Til udvinding af RNA anvendes reagenspakkerne, der anbefales af FBUN TsNII Epidemiology of the Rospotrebnadzor: Ved anvendelse af RIBO-sorb-reagenssætet, se fremgangsmåden i Tillæg 1 "Udvinding af RNA ved anvendelse af RIBO-sorb-reagenssætet". Ved anvendelse af RIBO-prep-reagenssætet, se proceduren i tillæg 2 "Udtrækning af RNA ved anvendelse af RIBO-prep-reagenssætet". ADVARSEL! Det resulterende præparat af RNA er ikke underlagt opbevaring, reaktionen er omvendt 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p. 14 af 32

15 FORT FRT transkription bør udføres straks efter modtagelse af RNA sonden. ANVENDELSE AF REVERSE TRANSKRIPTIONSREAKTIONER Det totale volumen af ​​reaktionsblandingen er 20 μl, inklusiv prøvevolumenet af RNA 10 μl. ADVARSEL! Ved arbejde med RNA er det nødvendigt at bruge kun engangsprodukter med specielle mærker "RNasefree", "DNase-free". A. Forberedelse af rør til revers transkription Til indsættelse af reagenser og RNA prøver i rør anvendes engangspidser med filtre. ADVARSEL! Komponenterne i reaktionsblandingen bør blandes umiddelbart før revers transkriptionsreaktionen. 1. Inden arbejdet påbegyndes, afrimes, blandes grundigt på vortex RT-mix og RT-G-mix-1. Dræne dråber fra testrørhætter. 2. Vælg det ønskede antal rør med et volumen på 0,2 eller 0,5 ml (afhængigt af modellen af ​​termostat eller forstærker), der anvendes til omvendt transkriptionsreaktion under hensyntagen til antallet af test- og kontrolprøver (en ekstraktionskontrol (OK)). Mærk rørene. 3. Ved udførelse af omvendt transkription af prøver: a) Forbered reaktionsblandingen til 12 reaktioner. Til dette gøres 5 μl RT-G-mix-1 til røret med RT-mix, blandes grundigt på en hvirvel og bundfald falder fra rørets låg. b) Tilsæt 6 μl revertase (MMlv) til den resulterende opløsning, pipette 5 gange, bland på en hvirvel. Dræn dråberne fra låget af røret ved kort centrifugering. 4. Ved udførelse af revers transkription på mindre end 10 prøver: For at fremstille reaktionsblandingen er det nødvendigt at blande reagenser pr. 1 reaktion i den følgende rækkefølge i følgende rækkefølge: 10 μl RT-blanding, 0,4 μl RT-G-mix-1 og 0, 5 μl revertase (MMlv) (se også tabel 1). Når der tilsættes en blanding af RT-G-mix-1 og revertase (MMlv), pipetteres hver reagens mindst 5 gange. Bland blandingen grundigt på en hvirvel og udfæld dråberne fra rørets låg. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 15 af 32

16 FRT FORMAT ATTENTION! Revertase (MMlv) er varmekänslig! Lad det ikke lade være ved stuetemperatur i lang tid! Sæt køleskabet i fryseren straks efter brug! Reagensmængden pr. Reaktion (μl) Antallet af kliniske prøver Reaktionsblandingsskemaet 10,00 0,4 0,5 RT-blanding RT-G-mix-1 Revertase (MMlv), 4,3, 8,3, 2 4,, 6 4, 0 5,0 5. Tilsæt 10 μl af den fremstillede reaktionsblanding til de fremstillede rør. Tabel 1 6. Tilsæt 10 μl RNA-prøver isoleret fra kliniske og kontrolprøver til de færdige rør ifølge mærkning. Vortex forsigtigt og bundfald falder fra hætteglassens låg. ADVARSEL! Når RNA-prøver isoleres under anvendelse af RIBO-sorbreagensættet, bør sorbenten undgås i reaktionsblandingen. B. Gennemførelse af omvendt transkriptionsreaktion 1. Sæt rørene i en forstærker (termostat) ved 37 ° C i 30 minutter. ADVARSEL! Ved anvendelse af forstærkere med et "real-time" detekteringssystem til omvendt transkription er det nødvendigt at programmere enheden for at udføre det passende program (se tabel 2 og "Retningslinjer for brug af et reagens kit til at detektere og differentiere hepatitis C-virus (HCV) genotyper) i klinisk materiale ved fremgangsmåden til polymerasekædereaktion (PCR) med hybridiseringsfluorescensdetektering "AmpliSense HCV-genotype-FL" ", udviklet af FBUN Central Research Institute of Epidemiology Rospotrebnadzor). Tabel 2 4 Volumener af de indførte reagenser gives under hensyntagen til antallet af de undersøgte prøver (kliniske prøver og 1 kontrol af RNA-ekstraktionstrinnet) og reserven pr. 1 prøve. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 16 af 32

17 FRT FORMAT Program til udførelse af omvendt transkriptionsreaktion for forstærkere med et realtidsdetekteringssystem 5 Steg Temperatur, C Trinnets varighed Fluorescensmåling Antal cyklusser min 1 2. Efter slutningen af ​​reaktionen tilsættes 20 μl DNA-buffer til rørene ved anvendelse af en ny filter tip for hver prøve. Bland forsigtigt på en hvirvel og fæld dråber fra hætteglassens låg. Den opnåede cdna i revers-transkriptionsreaktionen anvendes til PCR-amplifikation. Det færdige cdna-præparat kan opbevares ved en temperatur, der ikke er højere end minus 16 C i 1 uge eller ved en temperatur, der ikke er højere end minus 68 C i et år. FORDELING AF FORPLIGTELSE MED DETEKTION I REAL-TIME MODE A. Fremstilling af forstærkningsrør Valget af rør til amplifikation afhænger af den anvendte forstærker. Til indsætning af reagenser, cdna prøver og kontrolprøver i reagensglas, anvendes engangstip med filtre. Det totale volumen af ​​reaktionsblandingen er 25 μl, inklusiv et prøvevolumen af ​​cdna 10 μl. ADVARSEL! Komponenterne i reaktionsblandingen bør blandes umiddelbart før udførelse af PCR-undersøgelser. Blandingsreagenser baseret på det krævede antal reaktioner, herunder test af test- og kontrolprøver, er nødvendig i henhold til beregningstabellen (se tabel 3, 4). A1. Fremstilling af amplifikationsrør ved anvendelse af PCR-sætet, version FRT-g1-4 5 For eksempel Rotor-Gene 3000 eller 6000 (Corbett Research, Australien); Rotor-Gene Q (Qiagen, Tyskland); iq5 (Bio-Rad, USA); Mx3000P (Stratagene, USA); "DT-96" ("DNA-teknologi", Rusland) og anbefalet af FBUN Centrale Forskningsinstitut for Epidemiologi af Rospotrebnadzor i retningslinjer for brugen af ​​dette reagenssæt. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 17 af 32

18 FRT FORMAT 1. Inden arbejdet påbegyndes, afrim, grundigt vortex alle kit reagenser og bundfald dråber fra testrør caps. 2. Vælg det ønskede antal amplifikationsrør under hensyntagen til antallet af test- og kontrolprøver (en kontrol af RNA-ekstraktion, to amplifikationsstyringer). Type rør, der skal vælges afhængigt af den anvendte enhed. ADVARSEL! Hver prøve analyseres ved anvendelse af tre reaktionsblandinger, så for hver prøve er det nødvendigt at forberede 3 rør. Når du bruger enheder af den roterende type, skal du markere henholdsvis rørene "sample_1b / 3a", "sample_1a / 2" og "sample_vko / 4". Brug et mærket stativ til dette formål, når du bruger tabletter. 3. Vælg tre 0,5 ml rør til fremstilling af reaktionsblandingerne. Mærk rørene "1b / 3a", "1a / 2" og "VKO / 4". 4. Til hver af de tre rør beregnet til fremstilling af reaktionsblandinger tilsættes op til 1 reaktion: 5 μl RT-PCR-blanding-2-FEP / FRT, 0,5 μl polymerase (TaqF) og 10 μl af den tilsvarende PCR-blanding HCV -1-FRT-genotypen (se også tabel 3), PCR-mix-1-FRT af HCV-genotyperne 1b / 3a indføres i "1b / 3a" -røret osv. Bland de resulterende reaktionsblandinger på en hvirvel og bundfald falder fra hætteglassens hætte. ADVARSEL! Reaktionsblandingerne skal fremstilles med en margen på 1 prøve (se tabel 3). 5. Tilsæt rørene til amplifikation, 15 μl af den færdige reaktionsblanding i overensstemmelse med mærkningen, dvs. Reaktionsblandingen "1b / 3a" indføres i reagensglas mærket "prøve_1b / 3a" osv. 6. Tilsæt 10 μl cdna-prøver opnået i den omvendte transkriptionsreaktion på de fremstillede reagensglas med de dispergerede reaktionsblandinger i overensstemmelse med mærket, og hver prøve, herunder den negative ekstraktionskontrol (OK), skal tilsættes til 3 rør indeholdende de spredte reaktionsrør. en blanding af "1b / 3a", "1a / 2" og "VKO / 4". 7. Sæt kontrolreaktionerne: a) Tilsæt negativ kontrol af PCR (K) til reagensglasene med 1b / 3a, 1a / 2 og BKO / 4 scooped reaktionsblandinger af 10 μl TE buffer. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 18 af 32

19 FRT FORMAT b) positiv kontrol af PCR (K + 1b / 3a) i et rør med reaktionsblandingen "1b / 3a", tilsæt 10 μl OTP cdna HCV genotyper 1b / 3a; c) positiv kontrol af PCR (K + 1a / 2) i et rør med reaktionsblandingen "1a / 2" tilsæt 10 μl OTP cdna HCV genotyper la / 2; d) positiv kontrol af PCR (K + VKO / 4) i et reagensglas med VKO / 4-reaktionsblandingen. Tilsæt 10 μl PKO cdna HCV EKO / genotype 4. Beregning af reaktionsblandingerne for FRT-varianten Reagensvolumen pr. reaktion (μl) Antal Tal kliniske undersøgelsesprøver af punkt 6 10,00 5,00 0,50 6 Antal kliniske prøver + 1 kontrol af ekstraktionsfasen af ​​RNA + 2 kontrol PCR (N + 3, N antal kliniske prøver). PCR-mix-1-FRT HCV-genotype * RT-PCR-blanding-2-FEP / FRT * Tabel 3 Polymerase (TaqF) *,,,,,,,,, 0 * De anvendte reagensmængder gives med en margen på 1 prøve. A2. Fremstilling af amplifikationsrør ved brug af "PCR kit" -reagensætversionen FRT-g Før arbejdet påbegyndes, optø det grundigt, bland alle reagenserne i sættet på hvirveldyret, og udfæld dråberne fra rørets hætter. 2. Vælg det ønskede antal amplifikationsrør under hensyntagen til antallet af test- og kontrolprøver (en kontrol af RNA-ekstraktion, to amplifikationsstyringer). Type rør, der skal vælges afhængigt af den anvendte enhed. ADVARSEL! Hver prøve analyseres ved anvendelse af fire reaktionsblandinger, så for hver prøve er det nødvendigt at forberede 4 rør. Ved brug af rør med et volumen på 0,2 ml for instrumenter af rotortype markeres rørene henholdsvis "specimen_1b / 3a", "specimen_1a / 2", "specimen_vko / 4" og "specimen_5a / 6". Ved brug af enheder af tablettype eller ved brug af stribet 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 19 af 32

20 FRT FORMAT rør til roterende instrumenter bruger et markeret stativ til dette formål. 3. Vælg fire 0,5 ml rør til fremstilling af reaktionsblandingerne. Mærk rørene "1b / 3a", "1a / 2", "VKO / 4" og "5a / 6". 4. Til hver af de fire rør beregnet til fremstilling af reaktionsblandinger tilsættes op til 1 reaktion: 5 μl RT-PCR-mix-2-FRT HCV-genotype (se også tabel 4) med PCR-blanding 1- HCT FRT-genotyperne 1b / 3a indføres i "1b / 3a" -røret mv. Bland de resulterende reaktionsblandinger på en hvirvel og bundfald falder fra hætteglassens hætte. Ordning for fremstilling af reaktionsblandinger for FRT-varianten Reagensvolumen pr reaktion (μL) Antal Antallet af kliniske testprøver peger 7 10,00 5,00 0,50 FEP / FRT, 0,5 μl polymerase (TaqF) og 10 μl af den tilsvarende PCR-blanding -1-PCR-blanding-1-FRT HCV-genotype * RT-PCR-blanding-2-FEP / FRT * Tabel 4 Polymerase (TaqF) *,,,,,,,,, 0 * mængder af reagenser tilsat gives med en margen på 1 prøve. 5. Tilsæt rørene til amplifikation, 15 μl af den færdige reaktionsblanding i overensstemmelse med mærkningen, dvs. Reaktionsblandingen "1b / 3a" indføres i reagensglas mærket "prøve_1b / 3a" osv. I tilfælde af at der anvendes reaktionen til amplifikation af de stribede rør, skal reaktionsblandingerne indføres i overensstemmelse med skemaet vist i fig. 1. 7 Antallet af kliniske prøver + 1 kontrol af ekstraktionstrinnet af RNA + 2 kontrol PCR (N + 3, N antal kliniske prøver). 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 20 af 32

21 FRT FORMAT 4 rør anvendt til fremstilling af en enkelt klinisk prøve Blanding "1b / 3a" Blanding "1a / 2" Blanding "VKO / 4" Blanding "5a / 6" Blanding "1b / 3a" Blanding "1a / 2" Blanding BKO / 4 "Blanding" 5a / 6 "Figur 1. Skema for indføring af reaktionsblandinger og prøver ved anvendelse af strimmelrør til PCR. 6. Tilsæt 10 μl cdna-prøver opnået i den omvendte transkriptionsreaktion på de fremstillede reagensglas med de dispergerede reaktionsblandinger i overensstemmelse med mærket, og hver prøve, herunder den negative ekstraktionskontrol (OK), skal tilsættes til 4 rør indeholdende den spredte reaktion en blanding af "1b / 3a", "1a / 2", "VKO / 4" og "5a / 6". 7. Sæt kontrolreaktionerne: a) Tilføj den negative kontrol af PCR (K) med reagensglasene med 1b / 3a, 1a / 2, VKO / 4 og 4a / 6a 10 μl TE-buffer reaktionsblandinger. b) positiv kontrol af PCR (K + 1b / 3a) i et rør med reaktionsblandingen "1b / 3a" tilsæt 10 μl OTP cdna HCV genotyper 1b / 3a; c) positiv kontrol af PCR (K + 1a / 2) i et rør med reaktionsblandingen "1a / 2" tilsæt 10 μl OTP cdna HCV genotyper la / 2; d) positiv kontrol af PCR (K + VKO / 4) i et reagensglas med reaktionsblandingen VKO / 4, tilsæt 10 μl PKO cdna HCV VKO / genotype 4; e) positiv kontrol af PCR (K + 5a / 6) i et rør med reaktionsblandingen "5a / 6", tilsæt 10 μl OTP cdna HCV genotyper 5a / 6. B. Udførelse af forstærkning med detektering i "realtid" -tilstand 1. Programmér instrumentet (forstærker med detektionssystemet i "realtid" -tilstand) til at udføre det passende forstærkningsprogram og detektere fluoresceringssignalet "AmpliSens-1" (se tabel 5, 6 ). Tabel 5 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / s. 21 af 32

22 FRT FORMAT Program Amplisens-1 til enheder af roterende type 8 Temperatur, Varighed Måling Antal Trin C af fluorescensstadiet af Hold / Hold cykler min 1 Temperaturer 95 5 s Cykling / s 5 Cykling 95 5 s Cykling 2 / FAM / Grøn, s 40 Cycle 2 JOE / Yellow s Tabel 6 AmpliSens-1 program til tablet-type enheder 9 og Smart Cycler II (Cepheid, USA) Trin temperatur, varighedsmåling Nummer C i fluorescensstrinnet i cykler min (900 s 10 s) s 95 5 sekunder med FAM, JOE / HEX / Cy med 2. Monter rørene i cellerne i enhedens reaktionsmodul. 3. Start udførelsen af ​​amplifikationsprogrammet med detektion af det fluorescerende signal. 4. Ved afslutningen af ​​programmet fortsæt analysen og fortolkningen af ​​resultaterne. ANALYSE OG INTERPRETATION AF RESULTATER Analysen af ​​resultaterne udføres ved hjælp af den software, der anvendes af instrumentet til PCR c detektion i "realtid". Fluorescerende signalakkumuleringskurver analyseres for kanalen til FAM-fluoroforen (eller lignende) og kanalen til JOE-fluoroforen (eller lignende). Resultaterne er fortolket baseret på tilstedeværelsen (eller fraværet) på 8 For eksempel Rotor-Gene 3000 eller 6000 (Corbett Research, Australia), Rotor-Gene Q (Qiagen, Tyskland). 9 For eksempel, icycler iq5 (Bio-Rad, USA); Mx3000P, Mx3005 (Stratagene, USA); "DT-96" ("DNA-Technology", Rusland) og anbefalet af FBUN Centralforskningsinstitut for Epidemiologi af Rospotrebnadzor i retningslinjerne for anvendelsen af ​​dette reagenssæt. 10 For enheden Smart Cycler II (Cepheid, USA). 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 22 af 32

FRT FORMAT af skæringspunktet for fluorescenskurven med tærskellinjen sat på det passende niveau bestemmer tilstedeværelsen (eller fraværet) for denne prøve-cdna af værdien af ​​tærskelcyklussen Ct i den tilsvarende graf i resultattabellen. Kanalforstærkningsresultatet betragtes som positivt, hvis fluorescenskurven har et typisk S-formet udseende for realtids-PCR, en gang krydset med en tærskellinie i området med signifikant fluorescensforstærkning, negativ, hvis der ikke er nogen typisk kurve og ingen kryds med tærskellinjen (ingen Ct-værdi eller Cp) og tvivlsomt i alle andre tilfælde. Tabel 7 viser kanalerne ved hvilke HCV genotyper detekteres for hver reaktionsblanding. Tabel 7 Reaktionsblanding "1b / 3a" "1a / 2" "VKO / 4" "5a / 6 11" Kanal Detekterbare Genotyper HCV FAM / Grøn 1b 1a VKO 5a JOE / HEX / Gul / Cy3 3a Optagelse af resultater i kontrolprøver Resultater PCR-undersøgelser betragtes som pålidelige, hvis korrekte resultater opnås for at overføre kontrolprøver i overensstemmelse med evalueringstabellen over resultaterne af kontrolreaktioner (se tabel 8). 11 Inkluderet i PCR-sæt er variant FRT-g1-6. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 23 af 32

24 FRT FORMAT Reaktionsblanding Kontrol OK K K + 1b / 3a Resultater til kontrol af forskellige stadier af PCR-analysen FAM / Grøn Ingen Ct-værdi Mangler Ct-værdi Under grænseværdien Tabel 8 "1b / 3a" "1a / 2" "BKO / 4 »Resultater af amplifikation med JOE / HEX / gul / Cy3 kanal FAM / Grøn JOE / HEX / Gul / Cy3 FAM / Grøn JOE / HEX / Gul / Cy3 FAM / Grøn JOE / HEX / Gul / Cy3 Manglende værdi Ct Mangler Ct-værdi Under grænseværdien K + 1a / 2 * * Mangler Ct-værdi Mangler Ct-værdi Mangler Ct-værdi Mangler Ct-værdi Under grænseværdien Mangler Ct-værdi Mangler Ct-værdien mangler Ct-værdien mangler Ct-værdien mangler Ct-værdien mangler Ct-værdien mangler Ct-værdien mangler * * * * * * Under grænseværdien Under K + Vko-grænseværdien / 4 * * * * * * * * Under grænseværdien Under K-grænseværdien + 5a / 6 * * * * * * * Denne reaktionsblanding er ikke testet. * * Under grænseværdien OBS! Ct-grænseværdierne er angivet i insertet til PCR-sæt. Registrering af resultater i de undersøgte kliniske prøver Under grænseværdien 1. HCV-genotypen til stede i denne prøve er etableret ved at sammenligne amplifikationsresultaterne i tre (til PCR-sætet, variant FRT-g1-4) eller fire rør (til PCR-sæt option FRT-g1-6) i overensstemmelse med tabellen. 7 desuden: a) Hvis Ct-værdien for prøven bestemmes for prøven svarende til en enkelt HCV-RNA-genotype, er resultatet "Genotype"; b) Hvis der er fastsat to eller flere Ct-værdier for en prøve i resultattabellen, udstedes en dobbelt-, tredobbelt osv. genotype. En undtagelse er følgende: Hvis Ct-værdier bestemmes for en prøve på VKO / 4-reaktionsblandingen via JOE / HEX / Yellow / Cy3-kanalen (4 HCV genotype) og på 1b / 3a reaktionsblandingen på FAM / Green kanal (1b HCV), og Ct-værdien for den 4. genotype er mere end 10 Ct-værdier for den første genotype med 10 eller flere cyklusser, så er 12 FRT-g1-6-variant inkluderet i PCR-sæt. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 24 af 32

25 FRT FORMAT er resultatet af "Genotype 4". 2. Hvis der i resultattabellen for prøven kun bestemmes Ct-værdien for CTP (reaktion CTP / 4, kanal FAM / Grøn) og den er under grænseværdien angivet i indsætningen, er resultatet "HCV-genotypen ikke bestemt". Hvis det er kendt, at koncentrationen af ​​HCV RNA i denne prøve ligger inden for analysens følsomhed af reagenssætet, gives resultatet "HCV-genotypen er ikke bestemt på grund af lav viral belastning". 3. Hvis Ct-resultaterne for alle genotyper er fraværende i resultattabellen for prøven, og Ct-værdien for ASD (via FAM-kanalen på PCV-blandinger-1-FRT HCV EKO / genotype 4) ikke er defineret eller overstiger grænsen (angivet i indsatsen) Det er nødvendigt at gentage PCR-undersøgelsen af ​​denne prøve, begyndende fra scenen for RNA-ekstraktion. ADVARSEL! 1. Hvis Ct-værdien i mindst en prøve med positiv kontrol af PCR-scenen (K + 1b / 3a, K + 1a / 2, K + VKO / 4 eller K + 5a / 6) overstiger grænseværdien angivet i indsatsen eller er fraværende, er det nødvendigt gentag PCR-assayet for alle prøver ud fra ekstraktionstrinnet. 2. Hvis der for negativ kontrol af RNA-ekstraktion (OC) i det mindste på en af ​​reaktionsblandingerne "1b / 3a", "1a / 2", "5a / 6" langs en hvilken som helst anvendte kanal og / eller på reaktionsblandingen "VKO / 4" "Et positivt signal detekteres på JOE / HEX / Yellow / Cy3-kanalen. Det er nødvendigt at gentage PCR-undersøgelsen for alle prøver, for hvilke HCV-genotypen blev bestemt i denne reaktionsblanding, begyndende fra RNA-ekstraktionstrinet. 3. Hvis der for en negativ PCR-kontrol (K) påvises et positivt signal på en hvilken som helst reaktionsblanding langs en hvilken som helst af kanalerne, er det nødvendigt at gentage PCR-undersøgelsen for alle prøver, for hvilke HCV-genotypen blev bestemt i denne reaktionsblanding ud fra RNA-ekstraktionstrinet. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 25 af 32

26 SHELF LEVER, BETINGELSER FOR TRANSPORT OG LAGRING Udløbsdato. 12 måneder Det udløste reagenssæt er ikke anvendeligt. Udløbsdatoen for de åbne reagenser svarer til udløbsdatoen angivet på etiketterne for uåbnede reagenser, medmindre andet er angivet i instruktionerne. Transport. Et sæt reagenser skal transporteres ved en temperatur fra 2 til 8 ° C i højst 5 dage. Ved modtagelse demonteres i overensstemmelse med de angivne lagertemperaturer. Opbevaring. Opbevar reagenssæt "RIBO-sorb" og "RIBO-prep" ved en temperatur på 2 til 8 ° C. REVERTA-L og "PCR kit" reagenssæt med undtagelse af OKO, TE-buffer og CTP STI-248-rec opbevares ved en temperatur ikke højere end minus 16 ° C. EYE, TE-buffer og CTP STI-248-rec fra "PCR kit" bør opbevares ved en temperatur på 2 til 8 ° C. PCR mix-1-FRT HCV genotyper 1b / 3a, HCV PCR mix-1-FRT genotyper 1a / 2, HCV BKO / genotype PCR mix-1-FRT HCV / genotype 4 og PCR mix-1-FRT HCV genotyper 5a / 6 skal opbevares på et mørkt sted. Ferieforhold. Til behandlings-og-profylaktiske og sanitære institutioner. Klager på kvaliteten af ​​AmpliSense HCV-genotype-FL reagenssætet skal sendes til fabrikken i Federal Research and Development Institute of Epidemiology Rospotrebnadzor (Moskva, Novogireevskaya St., 3a) i afdelingen for genanvendelse og træning ("495), fax (495), Du kan forlade anmeldelser og forslag til produkterne fra AmpliSense ved at udfylde en forbrugerprofil på hjemmesiden: 2x (RG, IQ, MX, Dt, SC) / VER / s. 26 af 32

27 RNA EXTRACTION APPENDIX 1. Ekstraktion af RNA ved anvendelse af RIBO-sorbreagensættet. Fremgangsmåde 1. Lysisopløsning og vaskeopløsning 1 (hvis opbevaret ved 2 til 8 ° C), opvarmet til 60 ° C, indtil krystallerne er fuldstændigt opløst. 2. Vælg det ønskede antal 1,5 ml engangsrør (inklusive negativ ekstraktionskontrol). Mærk rørene. 3. I bunden af ​​hvert rør fremstilles 10 μl CTP STI-248-rec. 4. Tilsæt 450 μl lyseringsopløsning til rørene. Mærk rørene. Bemærkning Med et stort antal prøver for at lette udvælgelsesproceduren er det tilladt at blande i et separat hætteglas med lytisk opløsning og CTP STI-248-rec (pr. Prøve, 450 μl lysisopløsning og 10 μl CTP STI-248-rec) efterfulgt af adskillelse af 450 μl af blandingen i forberedte rør på 1,5 ml. 5. I testrør med lyseringsopløsning og ASD fremstilles 100 μl af hver prøve ved hjælp af tips med et filter. I et testrør med negativ kontrol (OK) ekstraktion tilsættes 100 μl af negativ kontrol. 6. Tæt lukkede prøver skal blandes grundigt på hvirvelen og centrifugeres i 5 s ved 5000 tpm i en mikrocentrifuge for at fjerne dråber fra den indvendige overflade af rørets låg. 7. Resuspender sorbenten ved vortexing kraftigt. Tilsæt 25 μl resuspenderet sorbent til hvert rør med en separat tip. 8. Rør indholdet af rørene på en hvirvel og lad det stå i 10 minutter ved stuetemperatur og bland grundigt hvert 2. minut. 9. Centrifug mikrocentrifugerørene ved 7000 g (for eksempel 10.000 omdr./min. For en MiniSpin, Eppendorf centrifuge) i 1 min. 10. Fjern supernatanten fra hvert rør med et separat spids ved hjælp af en vakuumsuger. 11. Tilsæt 400 μl vaskeopløsning til rørene. 1. Vortex indtil sorbenten er fuldstændigt resuspenderet. Centrifuger rørene i en mikrocentrifuge ved 7 tusind g i 1 min. Vælg supernatanten 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 27 af 32

28 RNA EXTRACTION fra hvert rør med et separat tip ved anvendelse af en vakuumsuger. 12. Tilsæt 500 μl vaskeopløsning til rørene. 3. Vortex indtil sorbenten er fuldstændigt resuspenderet. Centrifuger rørene i en mikrocentrifuge ved 7 tusind g i 1 min. Fjern vaskeopløsningen 3 fra hvert rør med en separat spids ved hjælp af en vakuumsuger. 13. Tilsæt 400 μl vaskeopløsning til rørene. 4. Vortex indtil sorbenten er fuldstændigt resuspenderet. Centrifuger rørene i en mikrocentrifuge ved 7 tusind g i 1 min. Vask vaskopløsningen 4 helt ud af hvert rør med en separat spids ved hjælp af en vakuumsuger. 14. Tør sorbenten ved at placere rørene med åbne hætter i en termostat ved 60 ° C i 15 minutter. 15. Resuspender sorbenten i 50 μl RNA buffer. Varmes i en termostat ved 60 ° C i 2 minutter, blandes på en hvirvel og præcipiterer sorbenten i en centrifuge ved 12.000 g (for eksempel omdr./min for en MiniSpin, Eppendorf centrifuge) i 1 minut. ADVARSEL! Det resulterende præparat af RNA kan ikke opbevares, den omvendte transkriptionsreaktion bør udføres straks efter modtagelse af RNA-prøven. Det er nødvendigt at vælge RNA-opløsningen til reaktionen meget omhyggeligt uden at fange sorbenten. Hvis sorbenten er omrørt, er det nødvendigt at udfælde det i en centrifuge. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 28 af 32

29 RNA EXTRACTION APPENDIX 2. Ekstraktion af RNA ved anvendelse af RIBO-prep-reagenssætet. Fremgangsmåde 1. Lysisopløsning (hvis den blev opbevaret ved en temperatur på 2 til 8 ° C) opvarmes til en temperatur på op til 65 ° C indtil fuldstændig opløsning af krystallerne. 2. Vælg det ønskede antal 1,5 ml engangsrør (inklusive negative og positive udtrækskontroller). 3. I bunden af ​​hvert rør fremstilles 10 μl CTP STI-248-rec. 4. Tilsæt 300 μl lysisopløsningen til rørene. Mærk rørene. Bemærkning Med et stort antal prøver for at lette tildelingsproceduren er det tilladt at blande lysisopløsningen og CTP STI-248-rec (pr. Μl prøve, 300 μl opløsningen til lysis og 10 μl CTP STI-248-rec) i et separat hætteglas efterfulgt af 300 μl af blandingen i præfabrikerede 1,5 ml rør. 5. I testrør med en opløsning til lysis og EKR tilsættes 100 μl af hver prøve ved hjælp af tips med et filter. I et testrør med negativ kontrol (OK) ekstraktion tilsættes 100 μl af negativ kontrol. 6. Vortex rørets indhold, centrifuger i 5 sekunder i en mikrocentrifuge for at fjerne dråber fra lågets indre overflade og opvarm i 5 minutter ved 65 ° C i en termostat. 7. Tilsæt 400 μl bundfældningsopløsning til rørene, bland omhyggeligt på en hvirvel. 8. Centrifug mikrocentrifugerørene ved 12.000 g (fx rpm for en MiniSpin, Eppendorf centrifuge) i 5 minutter. 9. Fjern forsigtigt supernatanten uden at røre sedimentet ved hjælp af en vakuumsugningsanordning og en separat spids til hver prøve. 10. Tilsæt 500 μl vaskeopløsning til rørene 3, luk lukkene forsigtigt, skyll sedimentet og drej rørene 3-5 gange. Det er muligt at udføre proceduren samtidigt for alle rørene, for det er nødvendigt at dække rørene i et stativ med et låg eller et andet stativ ovenpå, tryk dem og drej stativet over. 11. Centrifuger ved 12 tusind g i 1-2 minutter i en mikrocentrifuge. 12. Vælg uden supernatanten sedimentet, vælg supernatanten, 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 29 af 32

30 RNA EXTRACTION ved anvendelse af en vakuumsuger og en separat tip for hver prøve. 13. Tilsæt rørene 200 μl vaskeopløsning 4, luk lukkene forsigtigt, og skyll forsigtigt sedimentet og drej rørene 3-5 gange. Det er muligt at udføre proceduren samtidigt for alle rørene, for det er nødvendigt at dække rørene i et stativ med et låg eller et andet stativ ovenpå, tryk dem og drej stativet over. 14. Centrifuge ved 12 tusind g i 2 minutter i en mikrocentrifuge. 15. Omhyggeligt, uden at fange sedimentet, vælges forsigtigt supernatanten ved hjælp af en vakuumsuger og en separat spids til hver prøve. 16. Sæt rørene i en termostat ved 65 ° C i 5 minutter for at tørre bundfaldet (rørets hætter skal åbnes). 17. Tilsæt 50 μl RNA buffer til rørene. Rør vortexen. Placer i en termostat ved 65 ° C i 5 minutter, og skub lejlighedsvis på en hvirvel. 18. Centrifuger rørene ved 12 tusind g i 1 minut i en mikrocentrifuge. Supernatanten indeholder oprenset RNA. Prøver er klar til formulering af reaktionen af ​​revers transkription og PCR. ADVARSEL! Det resulterende præparat af RNA kan ikke opbevares, den omvendte transkriptionsreaktion bør udføres straks efter modtagelse af RNA-prøven. 2x (RG, IQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 30 af 32

31 SYMBOLER ANVENDT I PRINTET PRODUKT Katalog nummer Batch kode Forsigtig! Der henvises til den medfølgende dokumentation. Maksimalt antal prøver. Produkt til in vitro-diagnostik. Anvend op til ændringsdatoen. Temperaturgrænse. Øverste temperaturgrænse. Se instruktionsmanualen. Undgå direkte sollys. Fremstillingsdato. Producent 2x (RG, IQ, MX, Dt, SC) / VER / p. 31 af 32

32 Rev. LA IvI Der skal foretages ændringer Footer Footer Liste over ændringer Ændringens essens Tilføjet katalognummer R-V1-G (1-4) - 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) for formkonfigurationen 3 Fjernede katalognumre for former af konfigurationer 1 og 4 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / side 32 af 32

Amplisens hcv fl

Stadier af hepatitis c
Mpiviropack Price

Alt om hepatitis C

Behandling, symptomer, medicin

Hepatitis med rna amplicens hcv fl

Hepatitis med rna amplicens hcv fl

Hepatitis er en akut og kronisk inflammatorisk sygdom i leveren, ikke fokal, men udbredt. I forskellige hepatitis er infektionsmetoderne forskellige, de adskiller sig også i sygdomsprogressionshastigheden, kliniske manifestationer, metoder og prognoser for terapi. Selv symptomerne på forskellige typer af hepatitis er forskellige. Desuden forekommer nogle symptomer stærkere end andre, hvilket er bestemt af typen af ​​hepatitis.

Vigtigste symptomer

  1. Gulfarvning. Symptomet er almindeligt og skyldes, at bilirubin træder ind i patientens blod i tilfælde af leverskade. Blodet, der cirkulerer gennem kroppen, spredes gennem organerne og vævene og malerer dem gule.
  2. Udseendet af smerte i den rigtige hypokondrium. Det opstår på grund af stigningen i leverens størrelse, hvilket fører til udseende af smerte, som er kedeligt og langvarigt eller er paroxysmalt i naturen.
  3. Forværringen af ​​helbred, ledsaget af feber, hovedpine, svimmelhed, fordøjelsesbesvær, døsighed og sløvhed. Alt dette er en konsekvens af handlingen på kroppen af ​​bilirubin.

Hepatitis akut og kronisk

Hepatitis patienter har akutte og kroniske former. I den akutte form manifesterer de sig i tilfælde af viral skade på leveren, og også hvis der har været forgiftning af forskellige former for giftstoffer. I akutte former for sygdommen forværres patientens tilstand hurtigt, hvilket bidrager til den accelererede udvikling af symptomer.

Med denne form for sygdommen er det helt muligt gunstige fremskrivninger. Med undtagelse af at det bliver kronisk. I akut form er sygdommen let diagnosticeret og lettere at behandle. Ubehandlet akut hepatitis udvikler sig let i kronisk form. Nogle gange opstår der alvorlig forgiftning (for eksempel alkohol), den kroniske form uafhængigt. I den kroniske form af hepatitis forekommer udskiftning af leverceller med bindevæv. Det er svagt udtrykt, det er langsomt, og derfor forbliver det undertiden udiagnostiseret indtil leverens cirrose. Kronisk hepatitis behandles værre, og prognosen for dens kur er mindre gunstig. I sygdommens akutte forløb er tilstanden af ​​sundhed signifikant forværret, gulsot udvikler sig, forgiftning fremkommer, leverfunktionens funktion falder, og bilirubinindholdet stiger i blodet. Med den rette opdagelse og effektiv behandling af akut hepatitis, genopretter patienten oftest. Med en sygdomsvarighed på mere end seks måneder bliver hepatitis kronisk. Den kroniske form af sygdommen fører til alvorlige lidelser i kroppen - milt og lever forstørres, metabolisme forstyrres, komplikationer som levercirrhose og onkologiske formationer forekommer. Hvis en patient har nedsat immuniteten, er behandlingsregimen ikke korrekt eller der er alkoholafhængighed, så overgår overgangen til kronisk form for hepatitis patientens liv.

Hepatitis sorter

Hepatitis har flere typer: A, B, C, D, E, F, G, de kaldes også viral hepatitis, da årsagen til deres forekomst er virusen.

Denne type hepatitis kaldes også Botkins sygdom. Den har en inkubationsperiode på 7 dage til 2 måneder. Dets patogen, RNA-viruset, kan overføres fra en syg person til en sund person ved hjælp af produkter af lav kvalitet og vand, kontakt med husholdningsartikler, der anvendes af patienten. Hepatitis A er mulig i tre former, de er opdelt efter styrken af ​​sygdommens manifestation:

  • i akut form med gulsot, er leveren alvorligt beskadiget,
  • med subakut uden gulsot, kan vi tale om en lettere udgave af sygdommen,
  • i den subkliniske form kan man endda ikke bemærke symptomerne, selvom den inficerede person er kilden til viruset og er i stand til at inficere andre.

Denne sygdom kaldes også serum hepatitis. Ledsaget af en stigning i lever og milt, udseende af smerter i leddene, opkastning, temperatur, skader på leveren. Det forekommer enten i akutte eller kroniske former, som bestemmes af patientens immunitet. Infektionsmetoder: Under injektioner med overtrædelse af hygiejnebestemmelser, samleje, under blodtransfusion, brug af dårligt desinficerede medicinske instrumenter. Varigheden af ​​inkubationsperioden er 50 ÷ 180 dage. Incidensen af ​​hepatitis B reduceres ved anvendelse af vaccination.

Denne type sygdom er en af ​​de mest alvorlige sygdomme, da den ofte ledsages af cirrose eller levercancer, der senere fører til døden. Sygdommen er utilstrækkelig til behandling, og i øvrigt at have haft hepatitis C en gang, kan en person geninficeres med samme lidelse. Det er ikke let at helbrede HCV: Efter akut hepatitis C-sygdomme er 20% af patienterne gendannede, og hos 70% af patienterne er kroppen ikke i stand til at helbrede sig af virussen, og sygdommen bliver kronisk. At fastslå årsagen til, at nogle er helbredt selv, mens andre ikke er, er endnu ikke lykkedes. Den kroniske form for hepatitis C selv vil ikke forsvinde og skal derfor behandles. Diagnose og behandling af den akutte form af HCV udføres af en smitsomme sygdomsspecialist, den kroniske form af sygdommen er en hepatolog eller en gastroenterolog. Det er muligt at blive inficeret under transfusioner af plasma eller blod fra en inficeret donor, når man bruger medicinske værktøjer af dårlig kvalitet, seksuelt, og den syge mor overfører infektionen til barnet. Hepatitis C virus (HCV) spredes hurtigt over hele verden, antallet af patienter har længe overskredet et og et halvt hundrede millioner mennesker. Tidligere reagerede HCV ikke godt på terapi, men nu kan sygdommen helbredes ved hjælp af moderne direktevirkende antivirale midler. Kun denne terapi er ret dyr, og derfor har ikke alle råd til det.

Denne type hepatitis D er kun mulig, når den er coinficeret med hepatitis B-virus (coinfektion er et tilfælde af infektion i en enkelt celle med vira af forskellige typer). Han ledsages af en massiv leverskade og en akut sygdomssygdom. Måder ved infektion - at få sygdomsvirus i blodet af en sund person fra en virusbærer eller en syg person. Inkubationsperioden varer 20 ÷ 50 dage. Udadtil ligner sygdomsforløbet hepatitis B, men dets form er mere alvorlig. Kan blive kronisk ved at gå senere til cirrose. Det er muligt at udføre vaccination, svarende til den, der anvendes til hepatitis B.

Lidt minder om hepatitis A ved kurset og transmissionsmekanismen, da det også overføres gennem blod på samme måde. Dens funktion er forekomsten af ​​lynhurtige former, der forårsager død i en periode på højst 10 dage. I andre tilfælde kan det effektivt hærdes, og prognosen for genopretning er ofte gunstig. En undtagelse kan være graviditet, da risikoen for at miste et barn er tæt på 100%.

Denne type hepatitis er ikke blevet undersøgt nok. Det er kun kendt, at sygdommen er forårsaget af to forskellige vira: den ene blev isoleret fra blodet af donorer, den anden blev fundet i afføring af en patient, som fik hepatitis efter en blodtransfusion. Tegn: Udseende af gulsot, feber, ascites (væskeopsamling i bukhulen), en stigning i leverens og miltens størrelse, en stigning i niveauerne af bilirubin og leverenzymer, udseendet af forandringer i urinen og afføringen, samt generel forgiftning af kroppen. Effektive behandlingsmetoder for hepatitis F er endnu ikke udviklet.

Denne type hepatitis ligner hepatitis C, men ikke så farlig som den ikke bidrager til udviklingen af ​​cirrose og levercancer. Cirrose kan kun forekomme i tilfælde af samtidig infektion af hepatitis G og C.

diagnostik

I deres symptomer ligner viral hepatitis ligesom hinanden ligesom nogle andre virale infektioner. Af denne grund er det svært at fastslå patientens nøjagtige diagnose. For at præcisere typen af ​​hepatitis og den korrekte receptbehandling skal laboratorieblodprøver derfor identificere markørerne - indikatorer, der er individuelle for hver type virus. Efter at have identificeret tilstedeværelsen af ​​sådanne markører og deres forhold, er det muligt at bestemme sygdomsstadiet, dets aktivitet og det mulige resultat. For at kunne spore procesens dynamik, gentages undersøgelsen efter en periode.

Hvordan man behandler hepatitis C

Nuværende behandlingsregimer for kroniske former for HCV reduceres til antiviral kombinationsbehandling, herunder direktevirkende antivirale midler såsom sofosbuvir, velpatasvir, daclatasvir og ledipasvir i forskellige kombinationer. Ibland tilsættes ribavirin og interferoner for at forbedre deres effektivitet. Denne kombination af aktive stoffer stopper replikationen af ​​vira, hvilket redder leveren fra deres ødelæggende virkninger. Denne terapi har flere ulemper:

  1. Udgifterne til lægemidler til bekæmpelse af hepatitis B-virus er høje, ikke alle kan få dem.
  2. Accept af individuelle lægemidler ledsages af ubehagelige bivirkninger, herunder feber, kvalme, diarré.

Varigheden af ​​behandling af kroniske former for hepatitis tager fra flere måneder til et år afhængigt af virusets genotype, graden af ​​skade på kroppen og de anvendte lægemidler. Fordi hepatitis C primært påvirker leveren, skal patienterne følge en streng diæt.

Karakteristik af HCV genotyper

Hepatitis C er blandt de farligste virale hepatitis. Sygdommen er forårsaget af en RNA-indeholdende virus, kaldet Flaviviridae. Hepatitis C-virus kaldes også "kærlig morder". Han modtog en sådan flatterende epithet på grund af det faktum, at sygdommen i starten ikke ledsages af nogen symptomer. Der er ingen tegn på klassisk gulsot, og der er ingen smerter i det rigtige hypokondriumområde. Registrere tilstedeværelsen af ​​viruset kan ikke tidligere end et par måneder efter infektion. Og før det er immunsystemets reaktion helt fraværende, og det er umuligt at detektere markører i blodet, og derfor er det ikke muligt at udføre genotyping. Et særligt træk ved HCV er også det faktum, at viruset, efter at det kommer ind i blodbanen under reproduktionsprocessen, begynder at mutere hurtigt. Sådanne mutationer forstyrrer immunsystemet hos de smittede til at tilpasse og bekæmpe sygdommen. Som følge heraf kan sygdommen vare i flere år uden symptomer, hvorefter cirrose eller en ondartet tumor forekommer næsten uden skive. Og i 85% af tilfældene bliver sygdommen fra den akutte form kronisk. Hepatitis C-virus har en vigtig funktion - en række genetiske strukturer. Faktisk er hepatitis C en samling af vira, klassificeret i henhold til varianterne af deres struktur og opdelt i genotyper og subtyper. En genotype er summen af ​​gener kodende for arvede træk. Hidtil er 11 genotyper af hepatitis C-viruset, som har deres egne subtyper, kendt for medicin. Genotypen er angivet med tal fra 1 til 11 (selvom i kliniske undersøgelser genotyper hovedsageligt anvendes 1 ÷ 6) og undertyper med bogstaverne i det latinske alfabet:

I forskellige lande spredes HCV-genotyper på forskellige måder, for eksempel i Rusland kan man oftest findes fra første til tredje. Sværhedsgraden af ​​sygdommen afhænger af typen af ​​genotype, de bestemmer behandlingsregimen, dens varighed og resultatet af behandlingen.

Hvordan HCV-stammer spredes over hele verden

Over jordens territorium fordeles hepatitis C genotyper heterogent, og oftest kan genotyper 1, 2, 3 findes, og for enkelte territorier ser det ud som dette:

  • I Vesteuropa og dets østlige regioner er genotyper 1 og 2 mest almindelige,
  • i USA, undertyper 1a og 1b,
  • I Nordafrika er genotype 4 den mest almindelige.

Risikoen for en mulig HCV-infektion er mennesker med blodproblemer (tumorer i hæmatopoietisk system, hæmofili osv.) Samt patienter, der behandles i dialyseenhederne. Genotype 1 betragtes som den mest almindelige i verden; det står for

50% af det samlede antal sager. Det næststørste er genotype 3 med lidt over 30%. Spredningen af ​​HCV over Rusland har betydelige forskelle fra verdens eller europæiske versioner:

  • Genotype 1b står for

50% af sagerne

  • på genotype 3a

    20%

  • hepatitis 1a inficeret

    10% af patienterne

  • hepatitis med genotype 2 fundet i

    Men ikke kun vanskeligheden med HCV-terapi afhænger af genotypen. Følgende faktorer påvirker også effektiviteten af ​​behandlingen:

    • alder af patienter. Chancen for en kur er meget højere for unge
    • kvinder er lettere at komme sig end mænd
    • graden af ​​leverskade er vigtig - det gunstige resultat er højere med mindre skade,
    • størrelsen af ​​viral belastning - jo mindre viruset i kroppen på tidspunktet for behandlingen, jo mere effektiv terapi,
    • patientens vægt: jo højere det er, desto mere kompliceret er behandlingen.

    Derfor behandles behandlingsregimen af ​​den behandlende læge, baseret på ovennævnte faktorer, genotyping og anbefalinger fra EASL (European Association for Liver Diseases). EASL holder løbende sine anbefalinger opdaterede, og som nye effektive lægemidler til behandling af hepatitis C forekommer, korrigerer de anbefalede regimer.

    Hvem er i fare for HCV infektion?

    Som det er kendt, overføres hepatitis C-viruset gennem blodbanen, og det er derfor mest sandsynligt, at de bliver inficerede:

    • transfuserede patienter
    • patienter og klienter i tandklinikker og medicinske institutioner, hvor medicinske værktøjer er forkert steriliseret,
    • På grund af ikke-sterile instrumenter kan det være farligt at besøge søm og skønhedssaloner,
    • Piercing og tatovering elskere kan også lide af dårligt behandlede instrumenter,
    • der er en stor risiko for infektion for dem, der bruger stoffer på grund af gentagen brug af usterile nåle,
    • fosteret kan være inficeret af en moder inficeret med hepatitis C,
    • under samleje kan infektionen også komme ind i en sund persons krop.

    Hvad er behandlingen af ​​hepatitis C?

    Hepatitis C-virus blev betragtet som et "ømt" dræbervirus af en grund. Det er i stand til ikke at vise sig i årevis, hvorefter det pludselig forekommer i form af komplikationer ledsaget af cirrose eller levercancer. Trods alt har over 177 millioner mennesker i verden diagnosticeret HCV. Behandlingen, der blev anvendt indtil 2013, kombinerede injektioner af inetferferon og ribavirin, gav patienterne en chance for heling, der ikke oversteg 40-50%. Og desuden var det ledsaget af alvorlige og smertefulde bivirkninger. Situationen ændrede sig i sommeren 2013, efter at det amerikanske lægemiddelfirma Gilead Sciences patenterede stoffet sofosbuvir, der blev fremstillet som et lægemiddel under mærket Sovaldi, som omfattede 400 mg af lægemidlet. Det er blevet det første direktevirkende antivirale lægemiddel (DAA) til bekæmpelse af HCV. Resultaterne af de kliniske forsøg med sofosbuvir glædede læger med præstationen, som nåede 85-95% afhængigt af genotypen, mens varigheden af ​​behandlingsforløbet sammenlignet med behandling med interferoner og ribavirin var mere end fordoblet. Og selvom lægemiddelfirmaet Gilead patenterede sofosbuvir, blev det syntetiseret i 2007 af Michael Sofia, en ansat hos Pharmasett, senere erhvervet af Gilead Sciences. Fra navnet Michael var stoffet syntetiseret af ham kaldet sofosbuvir. Michael Sophia selv sammen med en gruppe forskere, der lavede en række opdagelser, der afslørede HCV's karakter, som gjorde det muligt for ham at skabe et effektivt lægemiddel til sin behandling, modtog Lasker-DeBakey-prisen til klinisk medicinsk forskning. Godt, næsten alle overskuddet fra salget af et effektivt nyt produkt gik til Gilead, som satte monopolistisk høje priser på Sovaldi. Desuden forsvarede virksomheden sin udvikling med et specielt patent, ifølge hvilket Gilead og nogle af selskabets partnervirksomheder blev ejerne af den eneret til at fremstille de originale DAA'er. Som følge heraf dækkede Gilead-overskuddet i de første to år af salget af lægemidlet gentagne gange alle de omkostninger, som selskabet havde afholdt for at erhverve Pharmasett, opnåede et patent og efterfølgende kliniske forsøg.

    Hvad er sofosbuvir?

    Effektiviteten af ​​dette lægemiddel i kampen mod HCV var så høj, at nu næsten ingen behandlingsregime kan gøre uden brug. Sofosbuvir anbefales ikke til monoterapi, men når det anvendes i kombination, viser det usædvanligt gode resultater. I første omgang blev lægemidlet anvendt i kombination med ribavirin og interferon, hvilket gjorde det muligt i ukomplicerede tilfælde at opnå en kur på kun 29 uger. Og det er trods det faktum, at kun interferon og ribavirinbehandling var to gange mindre effektive, og varigheden var undertiden overskredet 40 uger. Efter 2013 bragte hvert efterfølgende år nyheder om fremkomsten af ​​flere og flere nye lægemidler, der med succes bekæmpede hepatitis C-viruset:

    • I 2014 dukkede Daclatasvir op
    • 2015 var fødselsåret for Ledipasvir,
    • 2016 glædede sig over oprettelsen af ​​velpatasvir.

    Daclatasvir blev frigivet af Bristol-Myers Squibb i form af lægemidlet Daklinza, der indeholdt 60 mg aktiv bestanddel. Følgende to stoffer blev skabt af Gileads forskere, og da ingen af ​​dem var egnede til monoterapi, brugte de kun lægemidler i kombination med sofosbuvir. For at lette behandlingen frigives de forsigtigt genskabte lægemidler straks i kombination med sofosbuvir. Så der var stoffer:

    • Harvoni, der kombinerer sofosbuvir 400 mg og ledipasvir 90 mg,
    • Epclusa, der omfattede sofosbuvir 400 mg og velpatasvir 100 mg.

    Ved behandlingen med daclatasvir blev der taget to forskellige lægemidler, Sovaldi og Daclins. Hver af de parrede kombinationer af aktive ingredienser blev anvendt til behandling af visse HCV-genotyper ifølge de behandlingsregimer, der anbefales af EASL. Og kun kombinationen af ​​sofosbuvir med velpatasvir viste sig at være pangenotypiske (universelle) midler. Epclus kurerede alle genotyperne af hepatitis C med praktisk talt den samme høje virkningsgrad på ca. 97 ÷ 100%.

    Fremkomsten af ​​generiske stoffer

    Kliniske forsøg bekræftede effektiviteten af ​​behandlingen, men alle disse stærkt effektive lægemidler havde en stor ulempe - for høje priser, som ikke tillod dem at erhverve størstedelen af ​​de syge. De monopolistiske høje priser på Gileads produkter forårsagede voldshandlinger og skandaler, der tvang patenthaverne til at gøre visse indrømmelser, hvilket gav nogle virksomheder fra Indien, Egypten og Pakistan licenser til fremstilling af analoge (generiske) af sådanne effektive og efterspurgte stoffer. Desuden førte kampen mod patentindehavere, der tilbyder stoffer til behandling ved unobjectively oppustede priser, Indien, som et land, hvor millioner af patienter med hepatitis C lever i kronisk form. Som følge af denne kamp udstedte Gilead licenser og patentudviklinger til 11 indiske virksomheder for den uafhængige udgivelse af sofosbuvir først og derefter deres andre nye produkter. Efter at have fået licenser begyndte de indiske producenter hurtigt at fremstille generiske produkter og tildele deres egne mærker til fremstillede stoffer. Sådan begyndte den generiske sovaldi først, da Daklinza, Harvoni, Epclusa og Indien blev verdensledende inden for deres produktion. Ifølge licensaftalen betaler indiske producenter 7% af deres indtjening til fordel for patenthavere. Men selv med disse betalinger var kostprisen for generiske produkter produceret i Indien ti gange mindre end originalets.

    Handlingsmekanismer

    Som tidligere rapporteret er de nye HCV-behandlingsregimer relateret til DAA'er og virker direkte på virussen. Mens det tidligere blev brugt til behandling af interferon med ribavirin, styrkes det humane immunsystem, hvilket hjælper kroppen med at modstå sygdommen. Hvert af stofferne virker på sin egen måde på virussen:

    1. Sofosbuvir blokerer RNA-polymerase og derved hæmmer viral replikation.
    1. Daclatasvir, ledipasvir og velpatasvir er NS5A-hæmmere, der forhindrer spredning af vira og deres indtrængning i sunde celler.

    En sådan retningsvirkning gør det muligt at bekæmpe HCV med succes, ved hjælp af sofosbuvir i kombination med daklatasvir, ledipasvir, velpatasvir til terapi. Nogle gange, for at øge effekten på virussen, tilføjes en tredje komponent til parret, oftest ribavirin.

    Generiske producenter fra Indien

    Landets lægemiddelvirksomheder har udnyttet licenser tildelt dem, og nu frigiver Indien følgende Sovaldi-generik:

    • Hepcvir - producent Cipla Ltd.,
    • Hepcinat - Natco Pharma Ltd.,
    • Cimivir - Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • MyHep er en producent af Mylan Pharmaceuticals Private Ltd.,
    • SoviHep - Zydus Heptiza Ltd.,
    • Sofovir er en producent af Hetero Drugs Ltd.,
    • Resof - produceret af Dr. Reddy # 8217, s Laboratories,
    • Virso - releases styrker Arcolab.

    Daklins-analoger fremstilles også i Indien:

    • Natdac af Natco Pharma,
    • Dacihep fra Zydus Heptiza,
    • Daclahep fra Hetero Drugs,
    • Dactovin fra Strides Arcolab,
    • Daclawin fra Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • Mydacla fra Mylan Pharmaceuticals.

    Efter Gilead mødte indiske stofproducenter også Harvoni-produktion, hvilket resulterede i følgende generiske:

    • Ledifos - Hetero Udgivelser
    • Hepcinat LP - Natco,
    • Myhep LVIR - Mylan,
    • Hepcvir L - Cipla Ltd.,
    • Cimivir L - Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • LediHep - Zydus.

    Og i 2017 blev produktionen af ​​følgende indiske generikere Epclusi mestret:

    • Velpanat har udgivet Natco Pharma,
    • Velasof har mestret Hetero Drugs,
    • SoviHep V begyndte at producere selskabet Zydus Heptiza.

    Som du kan se, går de indiske medicinalfirmaer ikke bag de amerikanske producenter, der hurtigt nok styrker de nyudviklede stoffer, samtidig med at alle kvalitative, kvantitative og terapeutiske egenskaber respekteres. Forståelse inklusive farmakokinetisk bioækvivalens i forhold til originalerne.

    Generiske krav

    Et generisk lægemiddel er et lægemiddel, der er i stand til at erstatte behandling med dyre originale lægemidler med et patent med hensyn til dets grundlæggende farmakologiske egenskaber. De kan frigives, både når de er tilgængelige, og når der ikke er nogen licens, gør kun dets tilstedeværelse det analoge udstedes licenseret. I tilfælde af udstedelse af licenser til indiske medicinalfirmaer gav Gilead dem også produktionsteknologi, der giver licenstagere ret til uafhængige prispolitikker. For at en analog af et lægemiddel skal betragtes som en generisk, skal det overholde en række parametre:

    1. Du skal overholde forholdet mellem de vigtigste farmaceutiske komponenter i forberedelsen af ​​kvalitative såvel som kvantitative standarder.
    1. Følg de relevante internationale standarder.
    1. Obligatorisk overholdelse af korrekte produktionsbetingelser er påkrævet.
    1. I præparaterne bør en passende ækvivalent af absorptionsparametrene opretholdes.

    Det er værd at bemærke, at WHO er på vagt for at sikre tilgængeligheden af ​​lægemidler, der søger at erstatte dyre mærkevarer med hjælp af budgetgenerik.

    Egyptiske Soferbuvir Generics

    I modsætning til Indien blev de egyptiske lægemiddelvirksomheder ikke verdensledende inden for produktion af generiske lægemidler til hepatitis C, selv om de også mestrede produktionen af ​​analoger sofosbuvir. Imidlertid er hovedparten af ​​deres analoger ulicenseret:

    • MPI Viropack, producerer stoffet Marcyrl Pharmaceutical Industries # 8229, en af ​​de allerførste egyptiske generikere,
    • Heterosofir, udgivet af Pharmed Healthcare. Det er den eneste licenserede generiske i Egypten. På pakken under hologrammet er en kode gemt, hvilket gør det muligt at kontrollere originaliteten af ​​præparatet på fabrikantens hjemmeside og dermed udelukke sin forfalskning,
    • Grateziano, fremstillet af Pharco Pharmaceuticals,
    • Sofolanork, produceret af Vimeo,
    • Sofocivir, produceret af ZetaPhar.

    Generics til bekæmpelse af hepatitis fra Bangladesh

    Bangladesh er et andet land, der producerer generiske stoffer mod HCV i store mængder. Desuden kræver dette land ikke engang licens til fremstilling af analoger af mærkevarer, da medicinalvirksomhederne inden 2030 har lov til at udstede sådanne lægemidler uden tilstedeværelse af passende licensdokumenter. Den mest berømte og udstyret med den nyeste teknologi er lægemiddelfirmaet Beacon Pharmaceuticals Ltd. Projektet af dets produktionskapacitet blev oprettet af europæiske eksperter og overholder internationale standarder. Beacon frigiver følgende generiske lægemidler til behandling af hepatitis C-virus:

    • Soforal - generisk sofosbuvir indeholder det aktive stof 400 mg. I modsætning til traditionel emballage i flasker på 28 stykker fremstilles Sophoral i form af blister af 8 tabletter i en plade,
    • Daclavir er en generisk af Daclatasvir, en tablet af lægemidlet indeholder 60 mg af det aktive stof. Det fremstilles også i form af blister, men hver disk indeholder 10 tabletter,
    • Sofosvel er en generisk Epclusa, indeholder sofosbuvir 400 mg og velpatasvir 100 mg. Pangenotypisk (universal) lægemiddel, der er effektivt til behandling af HCV-genotyper 1 ÷ 6. Og i dette tilfælde er der ikke sædvanlig emballage i flasker, tabletter er pakket i blisterpakninger på 6 stk. I hver plade.
    • Darvoni er et komplekst stof, der kombinerer sofosbuvir 400 mg og daclatasvir 60 mg. Om nødvendigt kombinere sofosbuvir terapi med daklatasvir, ved brug af lægemidler fra andre producenter, skal du tage en pille af hver type. Og Beacon sætter dem sammen i en pille. Darvoni er pakket i blisterpakninger med 6 tabletter i en plade, der kun sendes til eksport.

    Ved køb af præparater fra Beacon baseret på behandlingsforløbet skal man tage højde for originaliteten af ​​deres emballage for at købe den nødvendige mængde til behandling. De mest berømte indiske medicinalfirmaer Som nævnt ovenfor, efter at landets lægemiddelvirksomheder fik licenser til frigivelse af generiske midler til HCV-terapi, blev Indien verdensledende inden for deres produktion. Men blandt mange af alle virksomheder er det værd at bemærke nogle få, hvis produkter i Rusland er de mest berømte.

    Natco Pharma Ltd.

    Det mest populære lægemiddelfirma er Natco Pharma Ltd., hvis medicin reddede livet for flere titusinder af mennesker med kronisk hepatitis C. Hun har mestret produktionen af ​​næsten hele rækken af ​​direktevirkende antivirale lægemidler, herunder sofosbuvir med daclatasvir og ledipasvir med velpatasvir. Natco Pharma dukkede op i 1981 i Hyderabad med en startkapital på 3,3 millioner rupier, så var antallet af ansatte 20 personer. Nu i Indien er der 3,5 tusind mennesker, der arbejder på fem Natco-virksomheder, og der er også filialer i andre lande. Ud over produktionsenhederne har virksomheden veludstyrede laboratorier, der gør det muligt at udvikle moderne medicinske præparater. Blandt hendes egne udviklinger er det værd at bemærke lægemidler til at bekæmpe kræft. Et af de mest kendte stoffer i dette område er Veenat, der er fremstillet siden 2003 og anvendes til leukæmi. Ja, og frigivelsen af ​​generiske midler til behandling af hepatitis C-virus er en prioritet for Natco.

    Hetero Drugs Ltd.

    Dette firma har sat sig som mål for produktionen af ​​generiske stoffer, der underordner dette aspiration til sit eget netværk af industrier, herunder fabrikker med filialer og kontorer med laboratorier. Hetero produktionsnetværk skærpes til fremstilling af lægemidler under licenser, der er opnået af selskabet. En af dens aktiviteter er medicinske præparater, der gør det muligt at bekæmpe alvorlige virussygdomme, hvis behandling er blevet umulig for mange patienter på grund af de høje omkostninger ved originale lægemidler. Den erhvervede licens giver Hetero mulighed for straks at fortsætte til frigivelsen af ​​generiske midler, som derefter sælges til en overkommelig pris for patienter. Oprettelsen af ​​Hetero Drugs går tilbage til 1993. I de seneste 24 år har der været et dusin fabrikker og flere dusin produktionsenheder i Indien. Tilstedeværelsen af ​​sine egne laboratorier gør det muligt for virksomheden at udføre eksperimentelt arbejde med syntese af stoffer, hvilket har bidraget til udvidelsen af ​​produktionsgrundlaget og den aktive eksport af stoffer til fremmede lande.

    Zydus heptiza

    Zydus er et indisk selskab, der har sat sig som mål at opbygge et sundt samfund, som ifølge sine ejere vil blive fulgt af en forandring til det bedre i menneskers livskvalitet. Målet er ædelt, og derfor for at nå det, driver virksomheden aktive pædagogiske aktiviteter, som påvirker befolkningens fattigste segmenter. Inkluderet ved fri vaccination af befolkningen mod hepatitis B. Zidus med hensyn til produktionsmængder i det indiske lægemiddelmarked er på fjerdepladsen. Derudover var 16 af dets lægemidler på listen over 300 vigtigste lægemidler i den indiske medicinalindustri. Zydus produkter er efterspørgsel ikke kun på hjemmemarkedet, de kan findes på apoteker i 43 lande på vores planet. Og rækken af ​​stoffer produceret hos 7 virksomheder overstiger 850 stoffer. En af sine mest magtfulde industrier er i staten Gujarat og er en af ​​de største ikke kun i Indien, men også i Asien.

    HCV Therapy 2017

    Hepatitis C behandlingsregimer for hver patient vælges individuelt af lægen. For det korrekte, effektive og sikre valg af ordningen skal lægen vide:

    • virusgenotype
    • sygdomsvarighed,
    • graden af ​​leverskader,
    • tilstedeværelse / fravær af cirrose, samtidig infektion (for eksempel HIV eller anden hepatitis), negativ erfaring med tidligere behandling.

    Efter at have modtaget disse data efter analysecyklusen vælger lægen den optimale behandlingsmulighed baseret på EASL's anbefalinger. EASL-anbefalingerne tilpasses fra år til år, de tilføjer de nyligt fremkomne stoffer. Før de foreslår nye behandlingsmuligheder, præsenteres de til behandling på kongres eller et specielt møde. I 2017 gennemgik EASL's særlige møde opdateringer til anbefalede ordninger i Paris. Det blev besluttet helt at afbryde interferonbehandling i Europa til behandling af HCV. Derudover var der ikke et enkelt anbefalet regime ved anvendelse af et enkelt, direktevirkende lægemiddel. Her er nogle anbefalede behandlingsmuligheder. Alle er udelukkende givet til fortrolighed og kan ikke blive en vejledning til handling, da kun en læge kan give en recept til behandling under tilsyn, som hun senere vil gennemgå.

    1. Eventuelle behandlingsregimer foreslået af EASL i tilfælde af mono-fektion ved hepatitis C eller samtidig infektion med HIV + HCV hos patienter uden cirrose og ikke tidligere behandlet:
    • til behandling af genotyper 1a og 1b kan du bruge:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir, uden ribavirin, varighed 29 uger, # 8229, sofosbuvir + daclatasvir, også uden ribavirin, behandlingsperiode på 29 uger, # 8229, eller sofosbuvir + velpatasvir uden ribavirin, kursusvarigheden er 29 uger.

    • i behandlingen af ​​genotype 2 anvendes uden ribavirin i 29 uger:

    # 8229, sofosbuvir + dklatasvir, # 8229, eller sofosbuvir + velpatasvir.

    • ved behandling af genotype 3 uden brug af ribavirin med en behandlingsperiode på 29 uger, brug:

    # 8229, sofosbuvir + daclatasvir, # 8229, eller sofosbuvir + velpatasvir.

    • under behandlingen af ​​genotype 4 er det muligt at anvende riboton i 29 uger uden ribavirin:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir, # 8229, sofosbuvir + daclatasvir, # 8229, eller sofosbuvir + velpatasvir.

    1. Anbefalede EASL-behandlingsordninger for hepatitis C-monoinfektion eller samtidig HIV / HCV-infektion hos patienter med komprimeret cirrose, der ikke tidligere er blevet behandlet:
    • til behandling af genotyper 1a og 1b kan du bruge:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir med ribavirin, varighed 29 uger, # 8229 eller 24 uger uden ribavirin, # 8229, og en anden mulighed - 24 uger med ribavirin med en ugunstig prognose for respons, # 8229, sofosbuvir + daclatasvir, hvis uden ribavirin, derefter 24 uger og med ribavirin, er behandlingsperioden 29 uger, # 8229, eller sofosbuvir + velpatasvir uden ribavirin, 29 uger.

    # 8229, sofosbuvir + dklatasvir uden ribavirin varer 29 uger, og med ribavirin, med en ugunstig prognose - 24 uger, # 8229 eller sofosbuvir + velpatasvir uden kombination med ribavirin i 29 uger.

    # 8229, sofosbuvir + daclatasvir i 24 uger med ribavirin, # 8229, eller sofosbuvir + velpatasvir igen med ribavirin, behandlingsperioden er 29 uger, # 8229, som en mulighed sofosbuvir + velpatasvir er muligt 24 uger, men uden ribavirin.

    • Ved behandling af genotype 4 anvendes de samme regimer som i genotyperne 1a og 1b.

    Som du kan se ud over patientens tilstand og kropsegenskabernes egenskaber påvirker kombinationen af ​​ordineret medicin valgt af lægen også resultatet af behandlingen. Derudover afhænger behandlingsvarigheden af ​​den kombination, som lægen vælger.

    Behandling med moderne HCV-stoffer

    Tag piller af medicin direkte antiviral virkning ordineret af en læge oralt en gang dagligt. De er ikke opdelt i dele, tyg ikke, men vaskes med rent vand. Det er bedst at gøre dette på samme tid, fordi en konstant koncentration af aktive stoffer i kroppen opretholdes. Det er ikke nødvendigt at blive knyttet til datoerne for fødeindtagelse, det vigtigste er ikke at gøre det på en tom mave. Når du begynder at tage medicin, skal du være opmærksom på dit velbefindende, da det i løbet af denne periode er nemmest at bemærke mulige bivirkninger. PPPPerne selv har ikke mange af dem, mens de lægemidler, der foreskrives i komplekset, er meget mindre. Oftest forekommer bivirkninger som:

    • hovedpine
    • opkastning og svimmelhed,
    • generel svaghed
    • tab af appetit
    • ledsmerter,
    • Ændringer i biokemiske biologiske parametre, udtrykt i lave hæmoglobinniveauer, fald i blodplader og lymfocytter.

    Bivirkninger er mulige hos et lille antal patienter. Men alt det samme om alle bemærket lidelser bør meddeles den behandlende læge for at træffe de nødvendige foranstaltninger. For at undgå forhøjede bivirkninger bør alkohol og nikotin udelukkes fra brugen, da de påvirker leveren negativt.

    Kontraindikationer

    I nogle tilfælde er modtagelse af DAA'er udelukket, det vedrører:

    • individuel overfølsomhed hos patienter til visse ingredienser af lægemidler,
    • patienter under 18 år, da der ikke er nøjagtige data om deres virkninger på kroppen,
    • kvinder, der bærer fosteret og ammer babyer,
    • kvinder bør anvende pålidelige præventionsmetoder for at undgå undfangelse i behandlingsperioden. Desuden gælder dette krav også for kvinder, hvis partnere også modtager DAA-terapi.

    Opbevar antivirale lægemidler med direkte virkning på steder, der er utilgængelige for børn og virkningen af ​​direkte sollys. Opbevaringstemperaturen skal ligge i området 15 ÷ 30ºС. Begynd at tage medicin, kontroller deres fremstillings- og opbevaringsdatoer, der er angivet på pakken. Forfaldne stoffer er forbudt. Sådan får du DAA'er til Ruslands borgere Desværre kan ikke indiske generikere findes på russiske apoteker. Farmaceutisk selskab Gilead, der udstedte licenser til frigivelse af lægemidler, forbød forsigtigt deres eksport til mange lande. Herunder i alle europæiske lande. Dem, der ønsker at købe billige indiske generika til at bekæmpe hepatitis C, kan drage fordel af flere måder:

    • Bestil dem gennem russiske onlineapoteker og få varerne om et par timer (eller dage) afhængigt af leveringsstedet. Og i de fleste tilfælde er det ikke nødvendigt med forudbetaling,
    • Bestil dem gennem indiske onlinebutikker med hjemmelevering. Her skal du have en forudbetaling i fremmed valuta, og ventetiden varer fra tre uger til en måned. Derudover er behovet for at kommunikere med sælgeren på engelsk tilføjet,
    • Gå til Indien og tag medikamentet selv. Det vil også tage tid, plus en sprogbarriere, plus vanskeligheden ved at verificere originaliteten af ​​de varer, der købes på apoteket. Til alt dette vil problemet med selvudførsel tilføjes, der kræver en termisk beholder, tilgængelighed af læge mening og en recept på engelsk samt en kopi af checken.

    Interesseret i at købe stoffer, beslutter folk for sig selv hvilke af de mulige leveringsmuligheder der skal vælges. Bare glem ikke, at i tilfælde af HCV afhænger et gunstigt resultat af terapi på hastigheden af ​​dets indtræden. Her i bogstavelig forstand er dødsforsinkelsen ligesom, og derfor bør du ikke forsinke procedurens begyndelse.